(CCK-8) 细胞增殖与活性检测试剂盒

Cell Counting Kit-8 (CCK-8) 细胞增殖与活性检测试剂盒是百萤生物生产的一种基于 WST-8 的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。其主要成分为水溶性四唑盐 WST-8 (2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐)，WST-8 是一种类似于 MTT 的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的水溶性的甲臜（formazan)。WST-8 被细胞内脱氢酶生物还原后生成的甲臜能够直接溶解在培养基中。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅;颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。使用酶标仪在450mM波长处测定OD值，间接反映活细胞数量。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。百萤生物是AAT Bioquest的中国代理商，为您提供最优质的荧光探针。

• CCK-8 细胞增殖与活性检测的专家
• CCK-8 常见问题详解

产品特点

本试剂盒提供了一种灵敏度高，操作简便，使用安全的细胞增殖与活性检测方法。与传统的 MTT 实验相比具有明显的优势：

1.MTT实验生成的甲臜不是水溶性的，需要使用 DMSO 等有机溶剂溶解；而本方法产生的甲臜是水溶性的，不仅省去了溶解步骤，更因此而减少了该操作步骤带来的误差。

2.与 MTT 方法相比，本方法线性范围更宽，灵敏度更高。

3.本方法对细胞无毒性，可以多次测定，选取最佳测定时间。

4.本方法所用试剂在培养基中比 MTT 更加稳定，实验结果重复性好。

5.MTT 具有毒性，同时其生成的甲臜需要有机溶剂溶解，会对操作人员身体造成危害。本试剂无毒，使用中无需有机溶剂，操作更加安全。

6.本试剂盒在-20°C 避光可长期保存，使用无需配制，即开即用。

本试剂盒可以用于生物活性因子的活性检测，抗肿瘤药物的筛选，细胞增殖的测定，细胞毒性检测以及药敏等与细胞活性和增殖相关的实验。本试剂盒使用方便，试剂盒包含一管已经配制好的含有 WST-8 的 CCK-8 溶液，即开即用，无需其他准备步骤。检测过程也无需采用额外的步骤去溶解甲臜，可直接使用 96 孔板或者 384 孔板在酶标仪上检测，适合大规模，高通量的样品检测。

实验方案

1.在96 孔板中配置100μL的细胞悬液（通常细胞增殖实验每孔加入100μL2000个细胞，细胞毒性实验每孔加入100μL5000个细胞。具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等因素决定)。按照实验需要，进行培养（在37°C，5%CO2的条件下）预培养24 小时。

2.向培养板加入1-10μL 不同浓度的待测药物刺激。

3.将培养板在培养箱孵育一段适当的时间（例如：6、12、24 或48 小时）。

4.每孔加入10μLCCK-8溶液（注意不要在孔中生成气泡，它们会影响OD 值的读数）。如果起始的培养体积为200μL，则需加入20μLCCK-8溶液，其它情况以此类推。可以用加了相应量细胞培养液和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。如果担心所使用的药物会干扰检测，需设置加了相应量细胞培养液、药物和CCK-8溶液但没有加入细胞的孔作为空白对照。

5.在细胞培养箱内继续孵育1-4小时，对于大多数情况孵育1小时就可以了。时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定，初次实验时可以在0.5、1、2和4小时后分别用酶标仪检测，然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。

6.用酶标仪测定在450nm处的吸光度，如无450nm滤光片，可以使用420-480nm的滤光片。可以使用大于600nm的波长，例如650nm，作为参考波长进行双波长测定。

7.如果暂时不测定OD 值，打算以后测定的话，可以向每孔中加入10 μL 0.1M 的HCL 溶液或者1% w/v SDS 溶液，并遮盖培养板避光保存在室温条件下。在24小时内吸光度不会发生变化。

注意：如果待测物质有氧化性或还原性的话，可在加CCK 之前更换新鲜培养基（除去培养基，并用培养基洗涤细胞两次，然后加入新的培养基），去掉药物影响。当然药物影响比较小的情况下，可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

注意事项：

1.由于使用96孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发的问题。一方面，由于96孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加PBS，水或培养液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培养箱内水源的地方，以缓解蒸发。

2.CCK-8检测细胞活性的原理是通过检测活细胞脱氢酶催化的反应。任何待测体系中存在还原剂，例如一些抗氧化剂会干扰检测，需设法去除。

3.建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和加入CCK-8试剂后的培养时间。

4.建议采用多通道移液器，可以减少平行孔间的差异。加入CCK 试剂时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基液面下加样，容易产生气泡，会干扰OD 值读数。

5.当使用标准96 孔板时，贴壁细胞的最小接种量至少为1,000 个/孔 (100 μL培养基)。检测白细胞时的灵敏度相对较低，因此推荐接种量不低于2,500 个/孔 (100 μL培养基)，且培养时间长一些。如果要使用24 孔板或6 孔板实验，请先计算每孔相应的接种量，并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。

6.加入CCK -8溶液时，如果细胞培养时间较长，培养基颜色已变化或pH值变化。建议换用新鲜的培养基。

7.如果没有450nm 的滤光片，可以使用吸光度在430-490 nm 之间的滤光片，但是450nm 滤光片的检测灵敏度最高。

8.酚红和血清对本试剂盒的测定无明显影响。培养基中酚红的吸光度可以在计算时，通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去，因此不会对检测造成影响。

9.为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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